PCR时,如果上下游引物Tm值相差较大该怎样设定反应程序?反应后有非特异性条带出现,只有一条,该怎样去除?

PCR时,如果上下游引物Tm值相差较大该怎样设定反应程序?反应后有非特异性条带出现,只有一条,该怎样去除? RT-PCR怎么都没法克隆出目的片段我用的上下游引物tm值相差较大,解决办法是先用低的退火温度跑5个循环,然后再用高退火温度的跑25个循环.试剂盒使用的是takara 一步法RT-PCR KIT请问各位针对这 pcr时如何进行上下游的引物设计? PCR中 两个引物的Tm值相差太大有什么害处? 同一模版DNA在进行PCR扩增时是不是需要不同的两种引物?为什么资料上说引物只要Tm值相似就行? 如果从primer5中得到引物的tm 值怎么确定pcr温度 我的引物该如何选择?我要设计兼并引物,但是两个最佳位置处的引物Tm值相差较大,而且有二聚体和发卡结构,其余的位置兼并位点较多,不敢用来设计引物,所以现在不知道该怎么办,请师兄师姐 追问引物设计第一次PCR的产物胶回收后用纯化吗,还是可以直接当做底物?目的基因3‘端GC含量太高,导致上下游引物Tm值差别太大,这样可以用吗?是不是内引物条件可以适当放宽?还有,我用的是p 请教如何计算出兼并引物的退火温度我是一个新手,如何根据公司送来的兼并引物的单子上的Tm值推出实际PCR时的退火温度呢?引物单子上有两个Tm值,分别是1M 钠离子,50mM钠离子条件下的Tm值.实 为什么做PCR设定引物退火温度时设定的退火温度要比合成引物得到的引物Tm值低几度? PCR时引物的概念包括加进去的酶切位点和保护碱基嘛?算进引物的长度吗?一块分析嘛?我设计的下游引物只有15个碱基,但primer5上的长度18个,如果我删去三个就不配对了（只是下游引物）,影响 为什么pcr 引物设计出来,下游引物加上酶切位点和保护碱基后,有一个Tm值是负值呀?还有,好多的Tm值都代表什么呢?引物Tm60多,二级结构的Tm达到40度有关系吗?G值有什么用 询问PCR退火温度设计引物单上数据如下上游TTACAAGATGGAGCCTCACC（GC含量50%）Tm（1M Na+）：68.2Tm（50mM Na+）：46.6下游CAAAGAATAACCCAGGACGA（GC含量45%）Tm（1M Na+）：66.2Tm（50mM Na+）：44.6顺便问下大家,Tm（1 求助巢式PCR退火温度的设定我最近准备做巢式PCR,下游引物用oligo dT,上游用两个基因特异性引物,但上游的两个引物和下游的oligo dT相比,Tm值差了将近10度,这样退火温度怎么设定呢? microRNA茎环引物及PCR上下游引物设计和扩增原理我在文献上看到一些用茎环引物反转录microRNA时,接下来的PCR的上游引物是包含了microRNA的5‘端一部分序列,而下游通用引物则为茎环上的一部分 做梯度PCR时,设置梯度值一般怎么结合上下游引物设?怎么让跑出的条带更特异?我一般能详细点回答更好了.我一般都是以上下游引物中最低的那个开始设,2度一个梯度,这次设计的引物特异性不 荧光定量PCR引物中含简并引物可以吗?设计荧光定量PCR引物时,保守片段中,上游引物有一个碱基不保守,下游引物有2个碱基不保守,因此在该位置设计为简并引物,不知道这样做可不可以?另外说 PCR反应温度怎么设置?由于刚刚开始做实验,什么都不懂,PCR引物的Tm值一条为50.6一条为54.3目标片段为195bp请问PCR反应程序该怎么设计啊?