追问引物设计第一次PCR的产物胶回收后用纯化吗,还是可以直接当做底物?目的基因3‘端GC含量太高,导致上下游引物Tm值差别太大,这样可以用吗?是不是内引物条件可以适当放宽?还有,我用的是p

来源：学生作业帮助网编辑：作业帮时间：2024/05/15 06:50:22

追问引物设计第一次PCR的产物胶回收后用纯化吗,还是可以直接当做底物?目的基因3‘端GC含量太高,导致上下游引物Tm值差别太大,这样可以用吗?是不是内引物条件可以适当放宽?还有,我用的是p
追问引物设计
第一次PCR的产物胶回收后用纯化吗,还是可以直接当做底物?目的基因3‘端GC含量太高,导致上下游引物Tm值差别太大,这样可以用吗?是不是内引物条件可以适当放宽?还有,我用的是pCMV-N-FLAG标签真核表达载体,不知道您用过没有,想问一下,双酶切连接之后,目的片段之前的那一段多克隆位点序列会不会翻译成多肽,会影响目的蛋白的表达吗?

追问引物设计第一次PCR的产物胶回收后用纯化吗,还是可以直接当做底物?目的基因3‘端GC含量太高,导致上下游引物Tm值差别太大,这样可以用吗?是不是内引物条件可以适当放宽?还有,我用的是p
第一次PCR产物不要做任何处理,直接吸取1微升做第二轮PCR的模板.第二轮PCR过后再跑胶回收你的目的条带.
外引物不在你的目的基因上,而在你的目的基因两侧.所以你设计外引物时是从一个很宽泛的范围内寻找最优的引物对,基本上不会遇到啥问题.而内引物,就是你目的片段的两端.
因为经过了第一次PCR,你的模板已经得到了一定的扩增纯化,所以就算内引物设计得很糟糕也没事,一端GC含量高,无非就是最后扩增效率低点,或是引物二聚体多些,但产物特异性还是能保证的.
如果真的因为内引物出了岔子（其实我遇到过这样的事）,那你就设计两对外引物,一对内引物.从外往里P,这样就能保证用到内引物时,模板真的很单一了,绝对万无一失.
至于担心之前的多克隆位点序列翻译成多肽,这完全不是个问题.这些位点的确会翻译成多肽,但这些多肽是无规卷曲,不会影响下游蛋白的构象.事实上,为了提高接下来亲和层析的效率,蛋白上所加的tag需要和目的蛋白有一定的距离,这样才能让tag和柱材上的配体结合时不受目的蛋白空间位阻的影响.
您明白了吗?欢迎追问!

追问引物设计第一次PCR的产物胶回收后用纯化吗,还是可以直接当做底物?目的基因3‘端GC含量太高,导致上下游引物Tm值差别太大,这样可以用吗?是不是内引物条件可以适当放宽?还有,我用的是p 低浓度模板的PCR扩增我的PCR模板来自于第一次PCR产物聚丙烯电泳后的回收片段；然后继续用第一次的引物扩增回收的目的片段；因为回收后的模板浓度比较低,对于低浓度、短片段模板（100-20 PCR产物回收后不纯,可以再接着用回收产物跑胶回收吗?请高手赐教, 为什么用RNA为模板,以基因组设计引物可以PCR出产物用DNaseI处理后,还是可以PCR出产物,请问还有其他原因吗? PCR的引物怎样设计, rt pcr的引物设计荧光素标记核酸的一些问题!@利用PCR技术,用荧光素标记引物扩增获得产物,用胶回收试剂盒回收后,利用紫外分光光度计测A260确定浓度,问题出来了,居然在A260处,吸光值为负值（空白光为蒸馏水用primer 5.0 设计引物的时候,哪个才是真正的PCR产物退火温度Tm,看哪个? PCR产物胶回收后的鉴定PCR产物胶回收后的CDNA鉴定除了拿去侧寻,是直接用来跑电泳还是再进行PCR后跑电泳? PCR扩增的产物中是不是也含有引物设计中的序列啊 realtime pcr 预实验的问题做realtime pcr 时,设计好引物后,用普通的pcr仪跑没有条带,是怎么回事啊?这样还能做realtime吗?排除引物设计的问题,因为是公司设计的. pcr后电泳的目的是?pcr 回收产物再做电泳的目的是? PCR的引物5‘端用荧光标记后扩增出的产物都有荧光标记吗 PCR的意义是不是要先知道具体DNA序列后才能设计引物进行PCR?如果是,那么我得到的是一段已知的序列,好像也可以人工合成这段序列而不需要PCR吧?用PCR得到的这些产物究竟可以用来做些什么事半定量RT-PCR设计引物时产物长度为多少合适我说的是产物长度的限制哦 PCR产物是单带,切胶回收纯化后,使用ABI3730进行测序,为什么测序没有反应呢?目的片段是120bp.我只是想知道为什么，至于解决方法，呵呵，我已经重新设计引物了。样本太多，一共200多个，建设计PCR引物的主要原则是什么? PCR引物设计应该注意的问题?